El museo se sitúa en dos estancias del ala este del patio. Por los restos encontrados, tipo de solado (canto rodado, ruedas de molino, etc.), la estancia principal podría formar parte de las antiguas caballerizas del palacio de los Antezana. Según se constata en la leyenda alta de la sala, tras un incendio, esta zona fue rehabilitada en 1520 como parte del ya del antiguo Hospital de Antezana.
La sala principal conserva restos de un gran alfarje mudéjar del siglo XVI, en cuyos aliceres aún se pueden observar los escudos de los fundadores, Luis de Antezana e Isabel de Guzmán.
Sala principal
Frente a la puerta de entrada: Sendos retratos de don Luis de Antezana y doña Isabel de Guzmán. Oleo sobre madera. Finales del siglo XV o principios del siglo XVI. Proceden de la capilla de Antezana en la antigua parroquia de Santa María (plaza de Cervantes), donde estuvieron enterrados los fundadores.
Sobre mesa rococó del siglo XVIII, cruz relicario jesuítica de estilo filipino. Siglo XVII. Marfil, madera y nácar. Imagen de San Diego de Alcalá (siglo XVIII) mostrando el motivo iconográfico del milagro de las flores.
Pared de la derecha desde la entrada: Virgen románica del siglo XIII. Posible procedencia del antiguo hospital medieval de San Julián o precedencia, como herencia, de la familia de Isabel de Guzmán. La hornacina barroca es de finales del siglo XVIII.
Vitrinas acristaladas
Izquierda: de arriba abajo. Libros. Tabla de Indulgencias de finales del siglo XVII. Relicario en tela del siglo XVIII. Arqueta relicario en alabastro del siglo XVII. Juego de mesa del siglo XVI (posiblemente de los usados por los internos del antiguo Hospital): cuchillo con mango de asta de toro, cuchara de madera, plato y escudilla. Clavos de diferentes épocas de la estructura de la cúpula de la iglesia. Mosquete (siglo XVII). Moneda del siglo XVI resellada en el siglo XVIII. Pavimento mudéjar (siglo XV) original del antiguo palacio de los Antezana.
Derecha: de arriba abajo. Libros. Recetarios médicos siglo XVI. Clavo reliquia que en 1773 tocó en Roma un clavo verdadero de la cruz de Cristo. Cabeza policromada de plomo de un niño Jesús de vestir del siglo XVIII. Azulejo proveniente del Colegio de Doncellas del convento de las Claras. Escribanía del siglo XIX con secante y cortaplumas. Palmatoria del siglo XVIII. Campanillas del siglo XVII. Sello del Hospital de Antezana del siglo XIX al que se le quitó la corona real en la II República. Troqueles de medallas conmemorativas del quinto centenario del antiguo Hospital de Antezana.
Cuadros: colección de pintura religiosa anónima (menos una firmada por Llamas) de los siglos XVII, XVIII (San Ignacio en Roma, Cristo de los Afligidos (Crucificado, siglo XVII, firmado por Llamas), fraile franciscano con San Francisco y Santa Clara, la Oración en el Huerto, Cristo atado a la columna).
Escultura: San Francisco Javier (madera policromada. Siglo XVII). Niño Jesús de vestir (madera policromada. Siglo XVIII).
Sala de documentos
Pared del fondo frente a la entrada: derecha: testamento de don Luis de Antezana y doña Isabel de Guzmán (18 de octubre de 1483). Centro arriba: bula del Papa Sixto IV de 1484 autorizando la fundación del antiguo Hospital de Antezana. Centro abajo: copia de la bula de Sixto IV decorada con el escudo de Antezana. Izquierda: codicilo o documento aclaratorio de los términos del testamento con valor jurídico fechado en 1484.
Pared derecha desde la entrada: diferentes bulas firmadas y selladas por autoridades eclesiásticas con distintas concesiones al antiguo Hospital de Antezana.
Pared izquierda desde la entrada: Acta de autorización al antiguo Hospital firmada y sellada por un Cardenal. Documentos administrativos del antiguo Hospital del siglo XVIII.
Vitrina central: Autorización de 1533 del arzobispo de Toledo Alonso de Fonseca para crear cementerio propio en el antiguo Hospital. Constituciones de la Cofradía de Ntra. Sra. de la Misericordia, de 1520, con encuadernación mudéjar. Tres documentos firmados por el Cardenal Cisneros aprobando diferentes autorizaciones al antiguo Hospital de Antezana.
